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科研技術(shù)服務(wù)
一、實(shí)驗(yàn)原理
Western Blot采用是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)， 經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。其圖解為：
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種：i.放射自顯影ii.底物化學(xué)發(fā)光ECL iii.底物熒光ECF iv.底物DAB呈色?，F(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
二、應(yīng)用簡(jiǎn)介
Western blot法應(yīng)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中時(shí)常會(huì)用到的一種實(shí)驗(yàn)方法，并且是一種能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量的分析方法。是通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，并且通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。
三、實(shí)驗(yàn)方法
四、樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
其他問題?
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對(duì)應(yīng)。?
（2）蛋白質(zhì)降解。蛋白質(zhì)降解后很可能會(huì)在比原來位置低的地方出現(xiàn)主帶，然后會(huì)出現(xiàn)一些其他帶，最主要特點(diǎn)是所有的條帶比正常的都低，并且條帶模糊不清晰。?
（3）所有條帶連成一片沒有間隔。原因最可能是上樣量過多，其次是樣品彌散（比如電泳長(zhǎng)時(shí)間停止樣品彌散）。?
（4）整個(gè)條帶呈?“?︶?”?狀：凝膠冷卻不均一，電泳槽老化。?
（5）整個(gè)條帶呈“?︵?”：?凝膠左右兩頭沒有凝固好。?
（6）溴酚藍(lán)拖尾：樣品溶解不好。?
（7）縱向的紋理：上樣樣品中存在不溶性顆粒。?
（8）溴酚藍(lán)很粗：濃縮膠濃縮效果不好，可能是濃縮膠太短，或者是濃縮膠配錯(cuò)。?
（9）在分離膠中跑不動(dòng)：Tris-HCl?PH值不對(duì)，或者忘記加SDS。
七、服務(wù)流程
