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科研技術(shù)服務(wù)
【實驗原理】
將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置于合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。
原代細胞保留了很多來源組織的重要生理特性，能高度模仿體內(nèi)的情況，且沒有遺傳和化學的改變。因此，原代細胞成為許多研究中理想的細胞模型。
【應(yīng)用簡介】
凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。通過原代分離獲得的細胞具有與體內(nèi)細胞相似的生物學特征，是研究生物體相關(guān)生命活動的理想材料。
【實驗方法】
（一）懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
（二）實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
（三）小鼠肝細胞原代培養(yǎng)
1、取肝臟：將小鼠斷頸致死，取肝臟；
2、除雜物：剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物；
3、研磨肝臟：用手術(shù)剪將臟器剪成小塊并研磨；
4、胰酶消化：加入胰酶消化，使細胞分離；
5、濾網(wǎng)去雜：用濾網(wǎng)過濾，除去大組織塊；
6、細胞計數(shù)：血球計數(shù)板計數(shù)。
【樣本送檢要求】
【案例展示】
【常見問題】
（1）原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。
（2）要注意無菌操作。其操作要求應(yīng)高于外科手術(shù)、
（3）整個取材操作要迅速，時間不能過長，以確保胚胎細胞活性。
（4）運用消化法時胰酶溫度應(yīng)低于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養(yǎng)細胞時的1~10min，而是至少20min，先消化下來的細胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過強，否則這些細胞易被損傷而不易生存。
（5）如使用組織塊法，則應(yīng)待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。
（6）原代培養(yǎng)操作時，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。
【服務(wù)流程】
