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科研技術(shù)服務(wù)
【實(shí)驗(yàn)原理】
細(xì)胞黏附性是維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基本條件，也是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)因素，并且對(duì)細(xì)胞的增殖、分化有重要影響。通?？煞譃閮深悾醇?xì)胞與細(xì)胞黏附和細(xì)胞與基質(zhì)黏附。機(jī)體內(nèi)許多細(xì)胞，如上皮細(xì)胞，需要牢固地定在某處發(fā)揮功能；另一些細(xì)胞，如白細(xì)胞，活躍運(yùn)動(dòng)，就需要不斷調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附。細(xì)胞黏附性的改變?cè)谀[瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴(kuò)散的能力，提示這些細(xì)胞在相互識(shí)別及黏附機(jī)制方面發(fā)生了改變。
【應(yīng)用簡(jiǎn)介】
細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecules，CAMs) 是一類膜表面糖蛋白，它們以配體－受體特異性結(jié)合的方式介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互接觸和結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，在胚胎發(fā)育和分化、正常組織結(jié)構(gòu)的維持、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、凝血和血栓形成、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。
細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)通常分為兩類，即細(xì)胞與細(xì)胞粘附和細(xì)胞與基質(zhì)粘附。機(jī)體內(nèi)許多細(xì)胞，如上皮細(xì)胞固定在某處發(fā)揮功能；另一些細(xì)胞，如白細(xì)胞，活躍運(yùn)動(dòng)，就需要不斷調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附。細(xì)胞粘附性的改變?cè)谀[瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴(kuò)散的能力，提示這些細(xì)胞相互識(shí)別及粘附機(jī)制發(fā)生了改變。用到測(cè)定細(xì)胞粘附性的實(shí)驗(yàn)有：機(jī)械法測(cè)定細(xì)胞粘附性，發(fā)射性核素法測(cè)定細(xì)胞粘附性，細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)和腫瘤細(xì)胞聚集體形成實(shí)驗(yàn)。
【實(shí)驗(yàn)方法】
1、將4.5×105個(gè)Hep3B細(xì)胞/孔傳代于無(wú)菌6孔培養(yǎng)板中。
2、培養(yǎng)24h后，用Lipofectamine?TM?2000將37LRP?siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞（兩個(gè)平行孔，Lipofectamine?TM?2000轉(zhuǎn)染具體操作見(jiàn)方法7），轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后收集細(xì)胞。同時(shí)各有兩個(gè)平行孔的細(xì)胞進(jìn)行陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度即siRNA終濃度為100nmol/L。?
3、培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，用0.25%胰酶將貼壁培養(yǎng)細(xì)胞（約1×106個(gè)）從壁上消化下來(lái)并制成單細(xì)胞懸液。?
4、用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基將Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜膠備用。
5、96孔板每孔中鋪Matrigel?2ug/50ul，放于超凈臺(tái)中風(fēng)干過(guò)夜。?
6、96孔板每孔加入適量無(wú)血清MEM細(xì)胞培養(yǎng)液(或PBS或生理鹽水)，放置60－90分鐘，洗去多余的膠；?
7、取轉(zhuǎn)染、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞以4×103/孔接種在鋪膠的96孔板中，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)20min、40min、60min。?
8、在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出96孔板，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，洗去未粘附細(xì)胞。
9、每孔加入100?ul甲醇，固定15min。?
10、每孔加入100?ul姬姆薩染液，染色15min，蒸餾水洗去染液。?
11、在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞數(shù)量（每孔在固定位置取8個(gè)視野）
【樣本送檢要求】
【案例展示】
【常見(jiàn)問(wèn)題】
1、細(xì)胞處理需要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。離心力在不損失細(xì)胞的前提下盡可能小，重懸細(xì)胞是動(dòng)作要輕柔，避免多次反復(fù)的激烈吹打，不用渦旋振蕩器。
2、染色培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異。一般情況下，白細(xì)胞較難染色，因此需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。培養(yǎng)時(shí)間一般為1-?4小時(shí)，但在培養(yǎng)30分鐘左右即可取出肉眼觀察。
3、染色程度?(根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索一下條件)。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000個(gè)/孔?(100μl培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500?個(gè)/孔?(100μl培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入染色液B。?
4、有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加染色液B試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD值讀數(shù)。?OD值在0.4-2.0之間均可，最大值控制在1.0左右為宜，小于0.4或大于2.0請(qǐng)調(diào)整接種量和培養(yǎng)時(shí)間。?
【服務(wù)流程】
