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科研技術(shù)服務(wù)
【實驗原理】
細(xì)胞劃痕法是簡捷測定細(xì)胞遷移運動與修復(fù)能力的方法，類似體外傷口愈合模型，在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其他硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實驗設(shè)定的時間，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察周邊細(xì)胞是否生長至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長遷移能力，實驗通常需設(shè)定正常對照組和實驗組，實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細(xì)胞對于劃痕區(qū)的修復(fù)能力，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力。
【應(yīng)用簡介】
細(xì)胞遷移：也成為細(xì)胞移動、細(xì)胞爬行或細(xì)胞運動，是細(xì)胞在接受遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。
細(xì)胞遷移參與到很多生理和病理的活動中，如下：
1. 免疫：如淋巴細(xì)胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關(guān)鍵之一；
2. 炎癥：炎癥反映最重要的功能是將白細(xì)胞送到炎癥灶，白細(xì)胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用；
3. 腫瘤轉(zhuǎn)移：遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中必不可少的環(huán)節(jié)之一。腫瘤細(xì)胞與母體瘤分離，穿越血管壁，侵襲周邊正常組織時，需要一定的運動能力。高轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞通常具奮較強的運動性。多種物質(zhì)可剌激腫瘤細(xì)胞的遷移，如腫瘤細(xì)胞分泌因子、生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分(FN、LN)以及一些癌轉(zhuǎn)移靶器官的代謝產(chǎn)物或分泌產(chǎn)物等生長因子對腫瘤細(xì)胞有趨化作用，可使其發(fā)生定向運動。測定方法以細(xì)胞劃痕法和Transwell小室法；
4. 損傷修復(fù)：當(dāng)機體發(fā)生損傷時，免疫細(xì)胞和血小板會遷移到損傷部位，參與消炎和凝血；
5. 胚胎發(fā)育：胚胎期不同類型祖細(xì)胞遷移至特意靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。
【實驗方法】
Culture Insert方法
1.準(zhǔn)備細(xì)胞，培養(yǎng)液，culture Insert。
2.如圖，將細(xì)胞接種于Dish中間的Insert，細(xì)胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500μm寬度的劃痕。
3.每隔4-6小時拍照記錄。
4.根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果。
傳統(tǒng)實驗方法
1.培養(yǎng)板劃線
首先使用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。劃線時注意線不要太粗 。
2.鋪細(xì)胞
在孔中加入約5×105個細(xì)胞（不同的細(xì)胞數(shù)量有所不同，根據(jù)細(xì)胞的生長快慢調(diào)整），接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%。
3.細(xì)胞劃線
第二天用槍頭或者無菌牙簽，垂直與細(xì)胞平面，沿著投一天劃在平板背面的線在細(xì)胞層上進(jìn)行劃痕(不同孔之間最好使用同一只槍頭或牙簽)。
4.洗細(xì)胞
劃痕完成后，使用無菌PBS洗細(xì)胞3次，洗去不貼壁的細(xì)胞，即劃線時劃線的細(xì)胞，是劃線后留下的間隙清晰可見，然后更換新鮮無血清培養(yǎng)基。
5.細(xì)胞培養(yǎng)、觀察
將細(xì)胞放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)臅r間點，如0，6，12，24h取出細(xì)胞，顯微鏡線觀察并測量劃痕的寬度，并拍照(具體時間依實驗需要而定)。
【樣本送檢要求】
【案例展示】
【常見問題】
1.鋪細(xì)胞最好使用6孔板，因為6空板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，而且因為有5條定位線，與劃痕相交，這樣就有10個可固定監(jiān)測點，不作重復(fù)，誤差也很小。當(dāng)然若是需要高通量初篩時，也可以用12或24孔板。
2.如果你連續(xù)監(jiān)測24小時，你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果，而不是單純的細(xì)胞遷移。如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移，你可以先用絲裂霉素（1 μg/ml）處理一小時，抑制細(xì)胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。另外，使用無血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對實驗結(jié)果的影響。
3.照片拍完之后，可以用image J來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。
4.雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會慢很多。
5.在用PBS緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞。
6.為了避免細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)受到影響，盡量不要用吸泵，可用移液槍緩慢吸走。
【服務(wù)流程】
